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用X射线自由电子激光拍摄“分子电影”,观看蛋白质利用太阳能输运氯离子
2021-03-26 14:44     

自然界有大量的生物能够利用太阳能驱动细胞功能,比如叶绿素的光合作用、昼夜节律调节、维持细胞内外电势差等。太阳能在细胞内的转化是如何完成的还需要大量的科学研究才能解密。

北京计算科学研究中心刘海广研究员和来自韩国、美国、日本以及澳大利亚的合作团队利用X射线自由电子激光设施(XFEL)开展了时间分辨的串行晶体衍射实验,研究蛋白质如何利用光能将氯离子输运到细胞内部。该国际联合团队最近解析出存在于某些海洋菌类细胞膜的氯离子输运蛋白分子(Chloride ion pumping Rhodopsin, 简称ClR)暗状态的原子模型,以及光子激发之后100皮秒(1皮秒=1万亿分之一秒 )期间的三维结构变化。这个原子分辨率的“分子电影”,清晰地描述了光子激发的引起的感光分子(Retinal)的异构化导致的氯离子的运动和蛋白质的结构变化。最新研究成果3月22日发表在Proceedings of the National Academy of Sciences (https://doi.org/10.1073/pnas.2020486118).

这是世界上第一次用实验的方法观测到光驱动的氯离子泵ClR的工作状态。在这个“分子电影”中,氯离子最初被氢键约束在Retinal附近靠近细胞外侧的一方。当用550纳米的飞秒激光脉冲激发蛋白之后,Retinal在1皮秒内迅速完成从“全反式”构型到“13-顺式”构型的转换,导致束缚氯离子的氢键网络被扰乱,从而将氯离子从束缚状态释放出来。获得自由的氯离子在局部空间开始扩散,并且在50-100皮秒的时刻内被高度保守的苏氨酸(Thr102)捕捉,准备朝细胞内运动。

应用美国斯坦福线性加速器中心国家实验室(SLAC)的X射线自由电子激光设施LCLS,国际合作团队收集了超过100 万亿字节(100 TB)的衍射数据,通过系统分析得出黑暗状态下氯离子泵的1.65埃的分辨率结构,以及飞秒激光脉冲照射后100皮秒以内4个时刻的结构。通过这些结构的比较、分析和关联,最终得出这个“分子电影”,展示光激发后的快速动力学。LCLS的飞秒激光脉冲能够突破辐射损伤导致的衍射极限,以“损伤前探测”的特有方式将大量(约1万亿个光子)压缩为100飞秒的脉冲照射微米尺度的蛋白质晶体。因为每个晶体只被测量一次,需要大量的蛋白质晶体依次到达X射线焦点进行衍射,由此得名“串行晶体衍射”。在晶体与X射线激光脉冲相遇之前,可以对晶体进行激发(即“泵浦”),就可以测量激发之后特定时刻的结构。这项研究工作就是应用这种“时间分辨的串行晶体衍射”的方法,并且结合精密光学仪器,能够把作为泵浦的550纳米激光脉冲和X射线脉冲到达晶体的时间精确控制在100飞秒的误差之内,从而测量了1皮秒,2皮秒,50皮秒和100皮秒时刻的结构。纳秒到微秒尺度的结构变化还在进一步分析之中,该团队将于2021年11月第四次去LCLS开展时间分辨晶体衍射实验研究,探测更多时间点的结构变化。

ClR除了能够将太阳能转化为化学能,研究光驱动的氯离子泵在健康和医学方面也具有重要的意义。氯离子泵具有七重跨膜螺旋,和人类细胞表面负责接收外界信号的受体蛋白GPCR (G蛋白耦合受体蛋白)在结构上非常接近,因此研究通过吸收光子驱动的氯离子泵结构变化对于理解GPCR的激活机理有借鉴意义。另外,视网膜的视蛋白(opsin)也是通过Retinal吸收光子感受外界信号,并转化为电信号传递给大脑,从而让我们看到这个多姿多彩的世界。科学家正在发展“光遗传学”的方法,争取通过调节光信号控制细胞状态。视紫红质蛋白Rhodopsin也是光遗传学的潜在分子开关,因此这个研究对于该领域的发展也有促进作用。

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图:光驱动的氯离子输运蛋白(氯离子泵)在黑暗状态通过席夫碱(Retinal与赖氨酸Lysine共享的氮原子携带一个质子,从而带正电)附近的氢键网络束缚氯离子。光照引发Retinal异构化,1皮秒之内氮原子快速远离氯离子,导致其对氯离子的吸引力降低,突然释放的氯离子先是在局部扩散,50100皮秒之后,被高度保守的Thr102捕捉,开始向细胞内侧方向运动。

“没有跨学科的交叉合作,这个项目不可能成功”。这个项目涉及到蛋白质提纯、晶体生长、微流装置操作、晶体衍射和数据分析、吸收光谱、分子动力学模拟、软件开发等诸多方面的技术和方法。北京计算科学研究中心的刘海广研究员与韩国延世大学Weontae Lee教授的团队从2014年就开始研究这个氯离子泵体系,并且于2016-2018年连续三年获得了LCLS对该项目的大力支持,也多次利用韩国的PAL-XFEL开展实验研究。在项目进行中,北京师范大学张文凯教授团队提供了重要的光谱研究结果,优化了时间分辨晶体学实验中重要的参数(比如泵浦激光的波长和功率),并且通过时间分辨瞬态吸收光谱分析了氯离子泵的光电化学状态和演化过程。美国能源部资助的BioXFEL科学技术中心(Science&Techonology Center)的团队提供了重要的技术和方法的支撑,主要包括亚利桑那州立大学Spence和Weierstall团队全程负责将大量的晶体样品通过LCP喷流装置准确输送到X射线焦点,威斯康辛大学Schmidt团队提供了对激发态结构的分析方法。本项目也得到日本横滨城市大学Sam-Yong Park团队的协作研究。

延世大学的Jihye Yun博士和北京计算科学研究中心与清华大学联合培养的李选选博士作为共同第一作者。Marius Schmidt,Weontae Lee和刘海广为共同通讯作者。本项目主要由中国国家自然科学基金会和韩国国家研究基金会资助,同时也得到美国NSF,NIH等机构的经费支持。

 

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